植物***原位杂交在线咨询「多图」

原位杂交是指；分子杂交的一种形式。由未经抽提分离的染色体DNA，在原来位置上被变性成单链后，与探针进行分子杂交。1977年由本顿(W.D.Benton)和戴维斯(R.W.D***is)在原分子杂交基础上发展的一种较新的分子杂交技术。方法是将菌落或噬菌斑转移到硝9酸纤维素滤膜上，使在原位发生溶菌后变性的DNA，同滤膜原位结合，再与有放5射性同位素标记的特定核苷酸“探针”杂交，其结果可用放5射自显影来显示，出现银粒的地方便是待测染色体DNA上与探针互补顺序所在的位置。对快速检测转化群落中的DNA序列或任何一种插入的DNA序列，以及动植物的******工作，都具有广泛应用价值。(见“分子杂交”、“放5射自显影”、“影印培养技术”)

间接标记的方法中应用了报告分子标记的探针，报告分子通过亲和酶促的方法进行显色。常用的报告分子如地高6辛，生物素。结合地高6辛抗6体或链霉亲和素上耦联的酶系统进行间接的底物反应检测。地高6辛标记核酸的历史可追溯到1987年，由于地高6辛是洋地黄的花和叶中特有的成分，检测时使用的地高6辛抗6体不会结合于其他的生物分子。这是相较于生物素标记系统的优势。地高6辛抗6体上可耦联碱性磷酸酶、过氧化酶，及荧光分子和胶体金等，根据不同的应用需求，呈现高信噪比的核酸检测结果。但需注意，由于引入了免6疫检测反应，在放大检测灵敏度的同时，应注意样品内源性酶的灭活，以降低检测背景。

通过不同标记方法的联合应用，还可在同一样本中实现染色体不同区域或细胞样本中不同RNA序列的多重检测。

杂交流程

杂交液的成分主要影响了核酸杂交的复性动力学和热稳定性。杂交液的基础成分为：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），异源核酸（如鲱精3子DNA/tRNA/竞争DNA），磷酸钠，EDTA，SDS，盐离子，甲酰胺和***葡聚糖，以及杂交探针。不同的应用中进行杂交温度、pH、盐离子、甲酰胺、探针浓度等条件的优化。常用的pH范围为6.5~7.5，较高的pH值有助于提高杂交的严谨性。

杂交技术***重要的因素之一是选择***适的杂交反应温度。若反应温度低于Tm 10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或更低些的DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。通常有三种温度可供试验，即***适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。温度的选择及温度对杂交的影响见表18-3。

***适复性温度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：Tor =Tm –25℃

苛刻复性温度：Ts = Tm – (10或15℃)

非苛刻复性温度：Tns =Tm – (30或35℃)