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原位杂交中探针的选择

DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针均能通过不同的酶促分子反应进行标记。寡核苷酸探针的长度较短，因此避免了探针内部退火的问题，在杂交时的渗透能力也更好，探针与靶标的接触这是影响原位杂交是否成功的重要因素之一。DNA探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度，通常300-1000bp左右，能覆盖到较长片段的靶核酸序列，增加检测的灵敏度。

另一种多聚体促进剂是聚丙0烯0酸，用其钠盐，浓度为2%～4%。与***葡聚糖相比，其优点是价格低廉，粘度低（MW=90 000）。小分子化学***酚和Guandine thiocyanate也能促进杂交，它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链DNA间的能量差异而发挥作用。酚作为杂交促进剂，只能在低DNA浓度的液相杂交中观察到，该方法曾被称为酚乳化复性技术，该法不能用于固相杂交，因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用，即使在液相杂交中的应用也是有限的。而Guandine thiocyanate可通过降低双链DNA的Tm值而起作用。此外，该分子还可以促进RNA的杂交，有裂解细胞而***RNase的作用。总之，***葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前***常用的杂交促进剂。



在选择探针类型的同时，还需要选择标记方法。探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。一般认为放0射性探针比非放0射性探针的灵敏度高。放0射性探针的实际灵敏度不依赖于所采用的标记方法，如随机引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性 。在检测单拷贝***序列时，应选用标记效0率0高、显示灵敏的探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统。